LA REPLICACIÓN DEL ADN: Semiconservativa, bidireccional y discontinua.

Mecanismo molecular de replicación del ADN

Funciones de las polimerasas de ADN y otras enzimas de replicación. Filamentos principales y rezagados y fragmentos de Okazaki.
   
La replicación de ADN es semiconservadora. Cada hebra en la doble hélice actúa como plantilla para la síntesis de una hebra nueva y complementaria.
    
El nuevo ADN se elabora con enzimas llamadas polimerasas de ADN, que requieren una plantilla y un primer (iniciador) y sintetizan el ADN en la dirección 5' a 3'.
   
Durante la replicación del ADN, una hebra nueva (la hebra principal) se hace como una pieza continua. El otro (correa rezagada) se hace en trozos pequeños.
    

La replicación de ADN requiere otras enzimas además de la DNA polimerasa, incluyendo ADN primase, DNA helicase, DNA ligase y topoisomerasa.

Introducción

La replicación del ADN, o la copia del ADN de una célula, no es una tarea sencilla!

Los mecanismos básicos de la replicación del ADN son similares en todos los organismos. En este artículo, nos enfocaremos en la replicación del ADN tal como ocurre en la bacteria E. coli, pero los mecanismos de replicación son similares en humanos y otros eucariontes.
 
Echemos un vistazo a las proteínas y enzimas que llevan a cabo la replicación, viendo cómo trabajan juntas para asegurar una replicación precisa y completa del ADN.

Sucede en la fase S del ciclo celular. Para replicar el ADN se separan sus 2 cadenas de nucleótidos enrolladas en hélice y cada cadena se usa de molde para fabricar su complementaria (otra nueva), resultando 2 hélices de ADN, cada una con 2 cadenas de nucleótidos en la que una de las cadenas es la del ADN antiguo, por lo que se llama replicación semiconservativa (una cadena se conserva y la otra es nueva).

La idea básica

Replicacion de ADN

La replicación del ADN es semiconservadora, lo que significa que cada hebra en la doble hélice del ADN actúa como una plantilla para la síntesis de una hebra nueva y complementaria.
Este proceso nos lleva de una molécula de inicio a dos moléculas "hijas", con cada nueva hélice doble formada conteniendo una nueva y una vieja hebra.

Para separar las 2 cadenas de nucleótidos actúa la enzima helicasa que reconoce una región del ADN llamada oriC o punto de iniciación y rompe los puentes de hidrógeno entre las bases produciendo la apertura de la doble hélice (separación de las 2 cadenas de nucleótidos), lo que origina una estructura llamada burbuja de replicación (donde se van formando las nuevas cadenas de ADN) que se va extendiendo (abriendo) en los dos sentidos, por lo que la replicación será bidireccional. 

En cierto sentido, ¡eso es todo lo que hay para la replicación de ADN! Pero lo más interesante de este proceso es cómo se lleva a cabo en una célula.
 
Las células necesitan copiar su ADN muy rápidamente, y con muy pocos errores (o problemas de riesgo como el cáncer). Para ello, utilizan una variedad de enzimas y proteínas que trabajan juntas para asegurar que la replicación del ADN se realice de manera suave y precisa.
 

ADN polimerasa

Una de las moléculas clave en la replicación del ADN es la enzima DNA polimerasa. Las polimerasas de ADN son responsables de sintetizar el ADN: añaden nucleótidos uno por uno a la cadena de ADN en crecimiento, incorporando sólo aquellos que son complementarios a la plantilla. 

He aquí algunas características clave de las polimerasas de ADN:

   
 Siempre necesitan una plantilla
   
 Sólo pueden añadir nucleótidos al final de una cadena de ADN de 3 pies.
    
No pueden empezar a hacer una cadena de ADN desde el principio, pero requieren una cadena preexistente o un pequeño tramo de nucleótidos llamado imprimación.
    
Corregen o revisan su trabajo, eliminando la gran mayoría de los nucleótidos "equivocados" que se añaden accidentalmente a la cadena.

La adición de nucleótidos requiere energía. Esta energía proviene de los nucleótidos mismos, que tienen tres fosfatos adheridos a ellos (como la molécula portadora de energía ATP). Cuando se rompe el vínculo entre los fosfatos, la energía liberada se utiliza para formar un vínculo entre el nucleótido entrante y la cadena creciente. [Vea la reacción de polimerización]
reacción de polimerización del ADN
 
El diagrama muestra una plantilla de hebra de ADN emparejada con una nueva hebra de ADN que se está sintetizando actualmente. Las bases del nuevo filamento y la plantilla forman pares complementarios unidos por enlaces de hidrógeno. Los dos hilos son antiparalelos. Sus secuencias son:
 
Nuevo capítulo: 5 "ACTG... 3" Capítulo de la plantilla: 3 "TGACAT 5".
Al final del nuevo capítulo, un grupo hidroxilo de 3' está expuesto al nucleótido final del capítulo. 

Este grupo hidroxilo experimentará una reacción química con un grupo fosfato en un nucleótido entrante, resultando en la formación de un nuevo enlace (y la adición del nucleótido al final de la cadena). Específicamente, el siguiente nucleótido expuesto en la plantilla es un A. El nucleótido complementario de un A es una T, por lo que cuando una T se empareja con la A en el filamento de la plantilla, sufrirá una reacción con el 3' hidroxilo al final de la cadena y será añadido.
 
El nucleótido consiste en un azúcar con una cadena de tres fosfatos, una base y un hidroxilo adherido. 

El 3' hidroxilo expuesto al final de la hebra en crecimiento formará un enlace con el fosfato más interno de la cadena del nuevo nucleótido, una reacción que libera una unidad de fosfato doble llamada pirofosfato. El pirofosfato se dividirá en dos iones de fosfato individuales. El resultado de la reacción es la adición del nucleótido T a la cadena creciente de ADN. El 3' hidroxilo del nucleótido T está ahora expuesto al final de la cadena. Este hidroxilo puede participar en una nueva reacción con el fosfato del próximo nucleótido que se agregará a la cadena.
 
Imagen basada en "DNA polimerasa" de Madeleine Price Ball, dominio público
En procariotas como E. coli, hay dos polimerasas de ADN principales involucradas en la replicación del ADN: DNA pol III (el mayor fabricante de ADN), y DNA pol I, que desempeña un papel crucial de apoyo que examinaremos más adelante.

Iniciando la replicación del ADN

¿Cómo saben las polimerasas de ADN y otros factores de replicación por dónde empezar? La replicación siempre comienza en lugares específicos del ADN, que se denominan orígenes de la replicación y son reconocidos por su secuencia.
 
E. coli, como la mayoría de las bacterias, tiene un origen único de replicación en su cromosoma. El origen es de aproximadamente 245245245245245 pares de bases largas y tiene en su mayoría pares de bases A/T (los cuales se mantienen unidos por menos enlaces de hidrógeno que los pares de bases G/C), haciendo que las hebras de ADN sean más fáciles de separar.
 
Las proteínas especializadas reconocen el origen, se unen a este sitio y abren el ADN. A medida que el ADN se abre, se forman dos estructuras en forma de Y llamadas horquillas de replicación, juntas formando lo que se llama una burbuja de replicación. Las horquillas de replicación se moverán en direcciones opuestas a medida que avanza la replicación. 

Imprimaciones y imprimaciones

Las polimerasas de ADN sólo pueden agregar nucleótidos al extremo de 3' de una cadena de ADN existente. (Ellos usan el grupo libre -OH encontrado en el extremo 3' como un "gancho", añadiendo un nucleótido a este grupo en la reacción de polimerización. ¿Cómo, entonces, agrega la DNA polimerasa el primer nucleótido a una nueva horquilla de replicación?
 
¡Solo, no puede! El problema se resuelve con la ayuda de una enzima llamada primasa. Primase hace una imprimación de ARN, o corto tramo de ácido nucleico complementario a la plantilla, que proporciona un 3' final para la polimerasa de ADN para trabajar en. Una imprimación típica tiene una duración de cinco a diez nucleótidos. La base de la síntesis de ADN, es decir, lo inicia.
Una vez que el imprimador de RNA está en su lugar, la DNA polimerasa lo "extiende", añadiendo nucleótidos uno por uno para crear una nueva hebra de ADN que es complementaria a la hebra de la plantilla.

Tramos principales y rezagados

En E. coli, la polimerasa de ADN que maneja la mayor parte de la síntesis es la DNA polimerasa III. Hay dos moléculas de DNA polimerasa III en una horquilla de replicación, cada una de ellas trabajando arduamente en una de las dos nuevas hebras de DNA.
 
Las polimerasas de ADN sólo pueden hacer ADN en la dirección 5' a 3', y esto plantea un problema durante la replicación. Una doble hélice de ADN siempre es antiparalela; en otras palabras, una hebra corre en la dirección de 5' a 3', mientras que la otra corre en la dirección de 3' a 5'. Esto hace necesario que los dos nuevos filamentos, que también son antiparalelos a sus plantillas, se fabriquen de maneras ligeramente diferentes.
 
Una hebra nueva, que corre de 5' a 3' hacia la horquilla de replicación, es la más fácil. Esta hebra se hace continuamente, porque la DNA polimerasa se mueve en la misma dirección que la horquilla de replicación. Esta hebra continuamente sintetizada se denomina hebra principal. 

 A la hebra molde (cadena de ADN antigua) se le van añadiendo nucleótidos para formar una hebra replicada (cadena de ADN nueva) gracias a la enzima ADN polimerasa. Esta enzima va añadiendo nucleótidos en el extremo 3´ (recordar del tema del ADN y ARN que los nucleótidos se unen por el carbono 3´ de una ribosa o desoxirribosa), por lo que la ADN polimerasa sólo puede añadir nucleótidos si la nueva cadena de ADN va en sentido 5´ 3´, además la ADN polimerasa necesita un fragmento de unos diez nucleótidos de ARN (cuidado no ADN) para tener algún extremo 3´ al que empezar a añadir nucleótidos de ADN, este fragmento de ARN se llama cebador o primer y lo sintetiza una enzima llamada primasa. 

La otra línea nueva, que va de 5' a 3' de distancia de la horquilla, es más tramposa. Esta hebra se fabrica en fragmentos porque, a medida que la horquilla avanza, la polimerasa de ADN (que se aleja de la horquilla) debe desprenderse y volver a adherirse al ADN recién expuesto. Esta espinosa hebra, hecha en fragmentos, se llama hebra rezagada.
 
Los pequeños fragmentos se llaman fragmentos de Okazaki, llamados así por el científico japonés que los descubrió. El filamento principal puede extenderse a partir de una sola imprimación, mientras que el filamento retardado necesita una nueva imprimación para cada uno de los fragmentos cortos de Okazaki.

El personal de mantenimiento y limpieza

Algunas otras proteínas y enzimas, además de las principales, son necesarias para mantener la replicación del ADN funcionando sin problemas. Uno es una proteína llamada la abrazadera deslizante, que mantiene las moléculas de la DNA polimerasa III en su lugar a medida que sintetizan el ADN.
 
La topoisomerasa también desempeña un importante papel de mantenimiento durante la replicación del ADN. Esta enzima evita que la doble hélice de ADN delante de la horquilla de replicación se hiera demasiado fuerte a medida que el ADN se abre. Actúa haciendo mellas temporales en la hélice para liberar la tensión, luego sella las mellas para evitar daños permanentes.
 
Finalmente, hay un poco de trabajo de limpieza que hacer si queremos ADN que no contenga ningún ARN o vacíos. Los cebadores de ARN son removidos y reemplazados por ADN a través de la actividad de la DNA polimerasa I, la otra polimerasa involucrada en la replicación. Las muescas que quedan después de la sustitución de los cebadores se sellan con la enzima DNA ligasa.
 

Resumen de la replicación del ADN en E. coli

Veamos cómo las enzimas y proteínas involucradas en la replicación trabajan juntas para sintetizar el nuevo ADN. 

• Helicasa abre el ADN en el tenedor de replicación.
• Las proteínas unipolares de unión recubren el ADN alrededor de la horquilla de replicación para evitar el rebobinado del ADN.
• La topoisomerasa trabaja en la región por delante de la horquilla de replicación para evitar el sobreenrollado.
• Primase sintetiza primers RNA complementarios a la hebra de ADN.
• DNA polimerasa III extiende los cebadores, añadiendo al extremo de 3', para hacer el grueso del nuevo ADN.
• Los cebadores de ARN son removidos y reemplazados con ADN por DNA polimerasa I.
• Los espacios entre los fragmentos de ADN son sellados por la DNA ligasa.

Replicación de ADN en eucariontes

Los fundamentos de la replicación del ADN son similares entre las bacterias y los eucariontes como los humanos, pero también hay algunas diferencias:

• Los eucariontes generalmente tienen múltiples cromosomas lineales, cada uno con múltiples orígenes de replicación.
• La mayoría de las enzimas E. coli tienen contrapartes en la replicación del ADN eucariótico, pero una sola enzima en E. coli puede estar representada por múltiples enzimas en los eucariontes.
• La mayoría de los cromosomas eucarióticos son lineales. Debido a la forma en que se hace la hebra retardada, algo de ADN se pierde de los extremos de los cromosomas lineales (los telómeros) en cada ronda de replicación.

En cada lado de la burbuja de replicación (horquillas de replicación) la ADN polimerasa sólo puede colocar nucleótidos en un sentido (5´ 3´) dando cadenas de ADN llamadas hebras conductoras. Como en el sentido opuesto

(3´ 5´) no se puede colocar nucleótidos, se soluciona formando hebras retardadas, ya que se sintetizan pequeños fragmentos de ADN llamados fragmentos de Okazaki que se dirigen en sentido (5´ 3´), resultando una replicación discontínua (a trozos).

Cada fragmento de Okazaki requiere su cebador, los cebadores y los errores en la replicación serán eliminados por la ADN polimerasa (los remplaza por ADN) y los fragmentos se sueldan por la enzima ligasa.